Neocentromery nie zawierają DNA charakterystycznego dla endogennych centromerów, tj. tandemowych układów sekwencji powtarzalnych; zatem rodzaj DNA nie decyduje o tożsamości neocentromerów. Tworzenie neocentromerów odbywa się przez mechanizmy epigenetyczne. Jest prawdopodobne, że ośrodkiem tworzenia neocentromerów w odcinkach euchromatynowych chromosomów mogłyby być ruchome elementy, które licznie występują w genomach eukariotycznych i są również obecne we właściwym centromerze oraz w przylegającej do niego heterochromatynie przycentromerowej. Wyniki badań metodą immunoprecypitacji wykazały, że kluczowe białko CENP-A/CENH3, decydujące o powstaniu centromeru, wiąże się z retorelementami. Nadekspresja tego białka u Drosophila powoduje jego pojawienie się w miejscach niecentromerowych chromosomów, powstanie funkcjonalnych neocentromerów i chromosomów policentrycznych, co skutkuje licznymi zakłóceniami w przebiegu mitozy. Mechanizm zapobiegający nadmiarowi i CID (homolog CENP-A u Drosophila) polega na proteolizie tego białka niezwiązanego z centromerami. Zastosowanie białek fuzyjnych CENP-A i jego homologów – GFP/YFP/EYEP pozwoliło na stwierdzenie, że u większości wyższych Eukaryota synteza i montowanie tego białka do nukleosomów chromatyny centromerowej odbywa się w fazie G2, u Drosophila – w fazie S, zaś u drożdży – podczas S i G2. O specyficznym dla centromerów montowaniu CENP-A/CENH3 decyduje obecność w ich C-terminalnym krańcu domeny docelowej, CATD. Montowanie CENP-A i homologów następuje również przy braku gatunkowo-specyficznego N-teminalnego krańca. Integralną częścią regionu centromerowego jest heterochromatyna, obecna we właściwym centromerze i w regionie przycentromerowym. W endogennych centromerach heterochromatyna wykazuje wszystkie epigenetyczne cechy właściwe dla heterochromatyny i nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny skondensowanej: metylację DNA, metylacje lizyn 9. i 27. w histonie H3 oraz lizyny 20. w histonie H4, brak acetylacji H3 i H4, obecność białka HP1. Te modyfikacje pojawiają się w regionie neocentromerowym powstałym w obrębie euchromatyny, ale w mniejszym stopniu niż w endogennych centromerach. Kohezyna, powodująca przyleganie siostrzanych chromatyd, pojawia się wraz z odtwarzaniem chromatyny, po replikacji DNA i preferencyjnie wiąże się z regionami heterochromatynowymi, z których jako ostania zanika przy heterochromatynie przycentromerowej. Ostatnio wykazano wiązanie kohezyny do odcinków euchromatynowych. Podczas ewolucji chromosomów następują zmiany w lokalizacji centromerów w wyniku ich dezaktywacji i powstawania neocentromerów. Uzyskane dotąd dane doświadczalne dotyczące tworzenia neocentromerów są nieliczne: nadal nie wiadomo, dlaczego neocentromery tworzą się zarówno w regionach eu-, jak i heterochromatyny oraz co – poza dezaktywacją endogennego centromeru – powoduje ich pojawienie.